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干貨課堂 | qPCR 樣品前處理

來源: | 作者:百菱生物 | 發(fā)布時間: 774天前 | 3056 次瀏覽 | 分享到:

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qPCR，即 Real Time PCR，也被稱為實時熒光定量 PCR，是實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)。上一期我們講了 qPCR 的學(xué)術(shù)用語和數(shù)學(xué)原理，這一期我們主要講 qPCR 的樣品前處理。

樣品采集

樣品采集是造成試驗差異的第一個潛在來源，特別是對檢測 RNA 的試驗。

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一類能夠催化 RNA 降解為小分子 RNA 的核酸酶，廣泛存在于真核生物、原核生物的所有細(xì)胞和組織中，通常具有極強(qiáng)活性，RNA 樣本中微量的 RNase 污染，就足以導(dǎo)致 RNA 樣本完全降解。

外源性污染源

對于外源性污染源，就需要在操作細(xì)節(jié)上注意，應(yīng)該使用 RNase free 耗材，高溫或 DEPC 處理的器皿，使用 RNA 實驗專用試劑，操作時戴口罩、手套，設(shè)置 RNA Free 工作區(qū)，避免交叉污染。

內(nèi)源性污染源

對于內(nèi)源性污染源，就需要在材料處理與保存方面注意。將材料保存在冰箱或者液氮中能夠很好的維持材料中核酸的穩(wěn)定性。有條件的情況下應(yīng)該立即提取或者液氮速凍。

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RNA 純度檢測

RNA 的純度會影響 cDNA 的合成量，所以在提取 RNA 后需要進(jìn)行 RNA 純度和質(zhì)量檢測。RNA 中的蛋白質(zhì)等有機(jī)物污染程度用 OD260/ OD280 來表示。

①1.8 < A260/280 < 2.0 為 RNA 質(zhì)量較好，符合要求。

②當(dāng) A260/ 280 < 1.8 時：表示蛋白或者其他有機(jī)物的污染比較明顯。

③當(dāng) A260/ 280 > 2.2 時：表示 RNA 已經(jīng)水解成單核酸。

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RNA 完整性檢測

RNA 完整性采用瓊脂糖凝膠電泳的方式進(jìn)行檢測。

完整的總 RNA 在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時會產(chǎn)生清晰的 28S 和 18S rRNA 條帶（真核樣品）。28S rRNA 條帶的強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)大致為 18S rRNA 條帶的兩倍。這種 2:1 的比率（28S：18S）是判斷 RNA 完整性的一個很好的指標(biāo)。最下面可能有淡淡的條帶 5.8S tRNA 等。如果觀察到有條帶大于 28S，就說明樣品中可能有基因組 DNA 的污染，這時候就需要使用 DNase I 進(jìn)行處理。

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基因組 DNA 污染

RNA 提取時，最值得注意的就是基因組 DNA 的污染物。那何時去除基因組 DNA 污染？一種是在 RNA 提取過程中去除，還有一種是在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)之前去除。

為什么要去除基因組 DNA 的污染呢？如下圖，反應(yīng) 3 是去除基因組進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實驗結(jié)果，反應(yīng) 4 是去除基因組不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實驗結(jié)果，反應(yīng) 3 和反應(yīng) 4 的結(jié)果就是正常的實驗結(jié)果。但是我們看反應(yīng) 1 和反應(yīng) 2，他們分別是不去除基因組進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和不去除基因組不進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)他們兩個在所做的熒光定量實驗中都檢測出了信號。由此可看出，基因組 DNA 的殘留對 qPCR 結(jié)果會造成很嚴(yán)重的影響。所以我們在實驗中應(yīng)該盡可能的把基因組 DNA 去除掉，從而保證我們數(shù)據(jù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。