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蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)步驟 ：

要進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法分析，在 4°C 下，將膜與稀釋的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^? 20 中一起孵育，輕晃孵育一整夜。

注意：請(qǐng)參閱一抗說明書或產(chǎn)品網(wǎng)頁了解建議使用的抗體稀釋度。

A. 溶液和試劑

注意：使用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級(jí)別的水制備溶液。

1. 20X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)：(#9808) 要制備 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 并混合。
2. 10 X Tris 鹽緩沖液 (TBS)：(#12498) 要制備 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH₂O 并混合。
3. 1X SDS 上樣緩沖液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通過添加 1/10 體積的 30X DTT 至 1 體積的 3X SDS 上樣緩沖液，以制備新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH₂O 將其稀釋至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液：(#4050) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液：添加 100 ml 10X 電泳緩沖液至 900 ml dH₂O 中并混合。
5. 10X Tris-Glycine 轉(zhuǎn)移緩沖液：(#12539) 要制備 1 L 1X 轉(zhuǎn)移緩沖液：將 100 ml 10X 轉(zhuǎn)移緩沖液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^? 20 (TBST) 的 10 X Tris 鹽緩沖液：(#9997) 要制備 1 L 1X TBST： 將 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脫脂奶粉：(#9999)。
8. 封閉緩沖液：含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST；要制備 150 ml，將 7.5 g 脫脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混勻。
9. 洗滌緩沖液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀釋緩沖液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制備 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混勻。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
14. 印跡膜：(#12369) 本實(shí)驗(yàn)步驟針對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行了優(yōu)化。通常推薦 0.2 μm 孔徑。
15. HRP 偶聯(lián)二抗：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
16. 檢測(cè)試劑：SignalFire? ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白質(zhì)印跡

制備樣品的常規(guī)流程。

1. 添加含有調(diào)節(jié)因子的新鮮培養(yǎng)基，使其對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理一段時(shí)間。
2. 從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基；用 1X PBS 洗滌細(xì)胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 樣品緩沖液（6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl）來裂解細(xì)胞。立即從板上刮下細(xì)胞并將提取物轉(zhuǎn)移至微量離心管。置于冰上。
4. 超聲處理 10–15 秒以完成細(xì)胞裂解并剪切 DNA（以降低樣品粘度）。
5. 取 20 μl 樣品，在 95–100°C 下加熱 5 分鐘；放在冰上冷卻。
6. 微量離心機(jī)內(nèi)離心 5 分鐘。

7. 上樣 20 μl 到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建議將預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品（#13953，10 μl/泳道）上樣，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)膜的效率，生物素化蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品（#7727，10 μl/泳道）可以直接在膜上顯出條帶以確定分子量。

8. 電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜 (#12369)。

C. 膜封閉和抗體孵育

注意：體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；對(duì)于不同尺寸的膜，可相應(yīng)調(diào)整體積。

I. 膜封閉

1. （可選）轉(zhuǎn)移之后，在室溫下用 25 ml TBS 將硝酸纖維素膜洗滌 5 分鐘。
2. 將膜置于 25 ml 封閉緩沖液中，在室溫下孵育 1 小時(shí)。
3. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

II. 一抗孵育

1. 將膜和一抗（按照產(chǎn)品說明書中建議的適當(dāng)稀釋度和稀釋液）置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時(shí)輕輕晃動(dòng)。
2. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。
3. 將膜與 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody（#7076，按 1:2000的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育并伴有輕輕搖晃，在室溫下孵育 1 小時(shí)，再檢測(cè) 10 ml 封閉緩沖液中的生物素化蛋白標(biāo)記物。
4. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。
5. 繼續(xù)進(jìn)行檢測(cè)（D 部分）。

D. 蛋白質(zhì)檢測(cè)

使用說明：

1. 在 TBST 中清洗與膜結(jié)合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持續(xù) 5 分鐘。
2. 通過稀釋一部分 2X 試劑 A 和一部分 2X 試劑 B（例如：要制備 10 ml，則添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B），來制備 1X SignalFire? ECL Reagent (#6883)?；靹?。
3. 將底物與膜一起孵育 1 分鐘，倒掉多余溶液（膜將保持濕潤），然后包裹在塑料中并在 X 線膠片下曝光。

* 避免反復(fù)接觸皮膚。

蛋白質(zhì)印跡法再標(biāo)記實(shí)驗(yàn)步驟

在樣品數(shù)量有限時(shí)，在現(xiàn)有的膜上反復(fù)單獨(dú)檢測(cè)多種蛋白進(jìn)行免疫印跡分析來說是一種非常方便的方法。應(yīng)注意的是，為了獲得最好的結(jié)果，始終建議您進(jìn)行新的印記實(shí)驗(yàn)以進(jìn)行分析。重新檢測(cè)是一種比較有效的方法，但在每一次重新檢測(cè)印跡時(shí)，背景信號(hào)可能會(huì)增強(qiáng)。此外，建議您在進(jìn)行重新檢測(cè)前確認(rèn)一抗復(fù)合體已被清除，以便與新抗體結(jié)合而產(chǎn)生的信號(hào)不是第一次免疫印跡實(shí)驗(yàn)的殘余信號(hào)。這可通過再次將印跡暴露于 ECL 試劑并確保在添加下一個(gè)一抗前無信號(hào)來確認(rèn)。

A. 溶液和試劑

注意：用反滲透去離子 (RODI) 水或等效凈化水制備溶液。

1. 洗滌緩沖液： Tris Buffered Saline with Tween^? 20 (TBST-10X) (#9997)
2. 洗脫緩沖液：要制備 100 ml，可將 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巰基乙醇混合。使用去離子化 H₂0 補(bǔ)足至 100 ml。僅在使用前制備新鮮的緩沖液。

B. 實(shí)驗(yàn)步驟

1. 膠片下曝光后，將膜置于 TBST 中清洗四次，每次 5 分鐘。在膜未干燥的情況下才可獲得最佳結(jié)果。
2. 在 50°C 下，在膜再生液中將膜孵育 30 分鐘，同時(shí)輕輕晃動(dòng)。
3. 在 TBST 中將膜清洗六次，每次 5 分鐘。
4. （可選）為了確保已清除原始信號(hào)，用 5 ml TBST 將膜清洗兩次，每次 10 分鐘。將膜與 LumiGLO^? 在室溫下孵育 1 分鐘，同時(shí)輕輕攪動(dòng)。將膜上多余的顯影液瀝干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射線膠片。
5. 再次在 TBST 中將膜清洗四次，每次 5 分鐘。
6. 膜現(xiàn)在可以再次使用了。根據(jù)免疫印跡分析實(shí)驗(yàn)步驟中的“膜封閉和抗體孵育”步驟開始檢測(cè)。