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蛋白質印跡法實驗步驟 ：

要進行蛋白質印跡法分析，在 4°C 下，將膜與稀釋的一抗放在 5% w/v BSA、1X TBS、0.1% Tween^? 20 中一起孵育，輕晃孵育一整夜。

注意：請參閱一抗說明書或產品網(wǎng)頁了解建議使用的抗體稀釋度。

A. 溶液和試劑

注意：使用反滲透去離子水 (RODI) 或同等級別的水制備溶液。

1. 20X 磷酸鹽緩沖液 (PBS)：(#9808) 要制備 1 L 1X PBS：加入 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH₂O 并混合。
2. 10 X Tris 鹽緩沖液 (TBS)：(#12498) 要制備 1 L 1X TBS：加入 100 ml 10X 至 900 ml dH₂O 并混合。
3. 1X SDS 上樣緩沖液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通過添加 1/10 體積的 30X DTT 至 1 體積的 3X SDS 上樣緩沖液，以制備新鮮的 3X 還原性上樣緩沖液。用 dH₂O 將其稀釋至 1X。
4. 10X Tris-Glycine SDS 電泳緩沖液：(#4050) 要制備 1 L 1X 電泳緩沖液：添加 100 ml 10X 電泳緩沖液至 900 ml dH₂O 中并混合。
5. 10X Tris-Glycine 轉移緩沖液：(#12539) 要制備 1 L 1X 轉移緩沖液：將 100 ml 10X 轉移緩沖液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH₂O 中，并混合。
6. 含有 Tween^? 20 (TBST) 的 10 X Tris 鹽緩沖液：(#9997) 要制備 1 L 1X TBST： 將 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH₂O 中并混合。
7. 脫脂奶粉：(#9999)。
8. 封閉緩沖液：含 5% w/v 脫脂奶粉的 1X TBST；要制備 150 ml，將 7.5 g 脫脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混勻。
9. 洗滌緩沖液：(#9997) 1X TBST。
10. 牛血清白蛋白 (BSA)： (#9998)。
11. 一抗稀釋緩沖液：含 5% BSA 的 1X TBST；要制備 20 ml，添加 1.0 g BSA 至 20 ml 1X TBST，然后充分混勻。
12. Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
13. Prestained Protein Marker, Broad Range (11-190 kDa)：(#13953)。
14. 印跡膜：(#12369) 本實驗步驟針對硝酸纖維素膜進行了優(yōu)化。通常推薦 0.2 μm 孔徑。
15. HRP 偶聯(lián)二抗：Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody (#7076)。
16. 檢測試劑：SignalFire? ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白質印跡

制備樣品的常規(guī)流程。

1. 添加含有調節(jié)因子的新鮮培養(yǎng)基，使其對細胞進行處理一段時間。
2. 從培養(yǎng)物中吸出培養(yǎng)基；用 1X PBS 洗滌細胞；吸出。
3. 加入 1X SDS 樣品緩沖液（6 孔板每孔 100 μl 或 10 cm 直徑的平板 500 μl）來裂解細胞。立即從板上刮下細胞并將提取物轉移至微量離心管。置于冰上。
4. 超聲處理 10–15 秒以完成細胞裂解并剪切 DNA（以降低樣品粘度）。
5. 取 20 μl 樣品，在 95–100°C 下加熱 5 分鐘；放在冰上冷卻。
6. 微量離心機內離心 5 分鐘。

7. 上樣 20 μl 到 SDS-PAGE 凝膠 (10 cm x 10 cm) 上。

   注意：建議將預染蛋白分子量標準品（#13953，10 μl/泳道）上樣，以驗證轉膜的效率，生物素化蛋白質標準品（#7727，10 μl/泳道）可以直接在膜上顯出條帶以確定分子量。

8. 電轉至硝酸纖維素膜 (#12369)。

C. 膜封閉和抗體孵育

注意：體積適用于 10 cm x 10 cm (100 cm²) 的膜；對于不同尺寸的膜，可相應調整體積。

I. 膜封閉

1. （可選）轉移之后，在室溫下用 25 ml TBS 將硝酸纖維素膜洗滌 5 分鐘。
2. 將膜置于 25 ml 封閉緩沖液中，在室溫下孵育 1 小時。
3. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。

II. 一抗孵育

1. 將膜和一抗（按照產品說明書中建議的適當稀釋度和稀釋液）置于 10 ml 一抗稀釋緩沖液中在 4°C 下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。
3. 將膜與 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody（#7076，按 1:2000的比例）和 anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，按 1:1000–1:3000 的比例）一起孵育并伴有輕輕搖晃，在室溫下孵育 1 小時，再檢測 10 ml 封閉緩沖液中的生物素化蛋白標記物。
4. 用 15ml TBST 洗滌三次，每次 5 分鐘。
5. 繼續(xù)進行檢測（D 部分）。

D. 蛋白質檢測

使用說明：

1. 在 TBST 中清洗與膜結合的 HRP (Antibody Conjugate) 三次，持續(xù) 5 分鐘。
2. 通過稀釋一部分 2X 試劑 A 和一部分 2X 試劑 B（例如：要制備 10 ml，則添加 5 ml 試劑 A 和 5 ml 試劑 B），來制備 1X SignalFire? ECL Reagent (#6883)?；靹颉?/span>
3. 將底物與膜一起孵育 1 分鐘，倒掉多余溶液（膜將保持濕潤），然后包裹在塑料中并在 X 線膠片下曝光。

* 避免反復接觸皮膚。

蛋白質印跡法再標記實驗步驟

在樣品數(shù)量有限時，在現(xiàn)有的膜上反復單獨檢測多種蛋白進行免疫印跡分析來說是一種非常方便的方法。應注意的是，為了獲得最好的結果，始終建議您進行新的印記實驗以進行分析。重新檢測是一種比較有效的方法，但在每一次重新檢測印跡時，背景信號可能會增強。此外，建議您在進行重新檢測前確認一抗復合體已被清除，以便與新抗體結合而產生的信號不是第一次免疫印跡實驗的殘余信號。這可通過再次將印跡暴露于 ECL 試劑并確保在添加下一個一抗前無信號來確認。

A. 溶液和試劑

注意：用反滲透去離子 (RODI) 水或等效凈化水制備溶液。

1. 洗滌緩沖液： Tris Buffered Saline with Tween^? 20 (TBST-10X) (#9997)
2. 洗脫緩沖液：要制備 100 ml，可將 1M Tris-HCl pH 6.8 的 6.25 ml、20% SDS 的 10 ml 和 700 μl β-巰基乙醇混合。使用去離子化 H₂0 補足至 100 ml。僅在使用前制備新鮮的緩沖液。

B. 實驗步驟

1. 膠片下曝光后，將膜置于 TBST 中清洗四次，每次 5 分鐘。在膜未干燥的情況下才可獲得最佳結果。
2. 在 50°C 下，在膜再生液中將膜孵育 30 分鐘，同時輕輕晃動。
3. 在 TBST 中將膜清洗六次，每次 5 分鐘。
4. （可選）為了確保已清除原始信號，用 5 ml TBST 將膜清洗兩次，每次 10 分鐘。將膜與 LumiGLO^? 在室溫下孵育 1 分鐘，同時輕輕攪動。將膜上多余的顯影液瀝干。切勿令膜干燥。包在塑料包裹膜中并曝光于 X 射線膠片。
5. 再次在 TBST 中將膜清洗四次，每次 5 分鐘。
6. 膜現(xiàn)在可以再次使用了。根據(jù)免疫印跡分析實驗步驟中的“膜封閉和抗體孵育”步驟開始檢測。